La exposición al ozono interrumpe la comunicación sexual de los insectos

Jul 03, 2023

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 1186 (2023) Citar este artículo

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La comunicación sexual de los insectos a menudo se basa en feromonas sexuales. Sin embargo, la mayoría de las feromonas de insectos contienen dobles enlaces carbono-carbono y potencialmente se degradan por oxidación. Aquí, mostramos que los niveles elevados de ozono antropocénico reportados con frecuencia pueden oxidar todas las feromonas masculinas descritas de Drosophila melanogaster, lo que resulta en cantidades reducidas de feromonas como el acetato de cis-vaccenilo y (Z) -7-tricoseno. Al mismo tiempo, la aceptación femenina de los hombres expuestos al ozono se retrasa significativamente. Curiosamente, los grupos de machos expuestos al ozono también exhiben niveles significativamente mayores de comportamiento de cortejo entre machos. Al repetir experimentos similares con otras nueve especies de drosofílidos, observamos degradación de feromonas y/o alteración del reconocimiento sexual en ocho de ellas. Nuestros datos sugieren que los niveles antropocénicos de ozono pueden oxidar ampliamente los dobles enlaces en una variedad de feromonas de insectos, lo que lleva a desviaciones en el reconocimiento sexual.

Encontrar y juzgar una pareja adecuada es fundamental para la reproducción en muchos animales. En este contexto, la mayoría de los insectos utilizan feromonas sexuales para discriminar congéneres de aloespecíficos e identificar el sexo y el estado de apareamiento de una pareja potencial1,2,3. Una feromona particularmente bien investigada es el acetato de cis-vaccenilo (cVA). Este compuesto es producido por el macho de Drosophila melanogaster, gobierna el reconocimiento del sexo y se ha demostrado que la cantidad de cVA presente en un macho se correlaciona con el atractivo del macho para una hembra4,5,6,7. Sin embargo, durante la cópula, el macho, para asegurar su paternidad, transfiere cVA a la hembra y, por lo tanto, reduce el atractivo de la hembra para otros machos6,8,9. Por tanto, el cVA es atractivo para las mujeres pero repulsivo para los hombres. Se sabe que muchas especies de moscas del género Drosophila producen compuestos masculinos específicos que aumentan su atractivo hacia hembras de su misma especie, se transfieren durante la cópula y, por lo tanto, parecen cumplir funciones similares a las de las feromonas, como la cVA en Drosophila melanogaster10,11. Aunque son químicamente diversas, la mayoría de estas feromonas potenciales comparten una característica específica: contienen dobles enlaces de carbono.

Durante el Antropoceno, los insectos que se comunican con feromonas insaturadas se enfrentan a un desafío potencial: la oxidación de dobles enlaces por niveles elevados de contaminantes oxidantes como el ozono12. Los sistemas de feromonas han evolucionado en la época preindustrial con valores de ozono troposférico tan bajos como 10 ppb13. Sin embargo, debido a la emisión continua de óxidos de nitrógeno (NOx), compuestos orgánicos volátiles (COV) y el cambio climático, el nivel de ozono ya ha aumentado a un promedio anual global de 40 ppb14. Se han informado eventos locales extremos de ozono en áreas industriales y urbanas de, por ejemplo, México, Bangladesh, Marruecos y China15,16,17,18. El ozono alcanzó en México una concentración de hasta 210 ppb (que duró una hora) y el valor medio más alto medido en 10 h superó los 170 ppb15. Aunque los valores de ozono varían mucho durante todo el año, el promedio anual medido, por ejemplo, en el noreste de China, aumentó de 45 ppb en 2003 a 62 ppb en 201516 y alcanzó un máximo diario promedio durante 8 h (MDA8) de 140 ppb observados. en marzo de 202019.

Aquí mostramos que incluso la exposición a corto plazo a niveles de ozono de 100 ppb da como resultado la degradación de muchas feromonas de drosophilid y reduce, por ejemplo, el atractivo de los machos para las hembras en 7 de 10 especies analizadas. Curiosamente, la exposición al ozono aumenta drásticamente el comportamiento de cortejo entre hombres, probablemente debido a una falta de discriminación sexual cuando las feromonas masculinas se degradan.

Primero investigamos si la cantidad de cVA de los machos de D. melanogaster (CS) se ve afectada por la exposición al ozono. De hecho, al comparar con moscas de control expuestas al aire ambiente (con 4,5 ± 0,5 ppb de ozono) únicamente, encontramos cantidades reducidas de cVA en moscas que estuvieron expuestas a 100 ppb de ozono durante 2 h (Fig. 1, para un esquema del ozono). configuración ver Fig. S1) y mayores cantidades de heptanal (Fig. S2), un posible producto de descomposición de la oxidación de cVA. Curiosamente, muchos otros compuestos de feromonas como (Z)-7-tricoseno (7-T) y (Z)-7-pentaseno (7-P)20, que se sabe que están involucrados en el comportamiento reproductivo, disminuyeron después de la exposición al ozono. también (Fig. 1c).

a Dibujo esquemático del protocolo analítico TDU GC-MS. Las moscas macho fueron expuestas por primera vez al ozono o al aire ambiente. Luego se analizó su perfil químico mediante TDU GC-MS. b Perfiles químicos de machos de D. melanogaster después de la exposición al ozono (rosa) o al aire ambiente (gris). Cromatogramas (panel izquierdo), estructuras químicas de feromonas masculinas e hidrocarburos cuticulares, CHC (panel derecho). c, Análisis cuantitativo de feromonas masculinas y AHC. (Prueba t no pareada de dos colas; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Luego preguntamos si estos cambios en los perfiles químicos de los machos afectarían su atractivo para las moscas hembras. Por lo tanto, expusimos moscas macho durante 30 minutos a ozono que oscilaba entre 50 y 200 ppb o, como control, al aire ambiente y luego probamos su comportamiento de cortejo y éxito de apareamiento con hembras no expuestas en un ensayo de apareamiento sin elección (Fig. 2a). Los machos expuestos al ozono no difirieron de los machos de control con respecto a su latencia de cortejo (es decir, el tiempo hasta que comenzaron a cortejar a la hembra; Fig. 2a) y el porcentaje de cortejo (es decir, el porcentaje de machos que cortejaron a las hembras, Fig. S3). , lo que muestra que la motivación del cortejo masculino no parece verse afectada por la exposición previa al ozono. Al mismo tiempo, aunque la mayoría de los machos finalmente se aparearon dentro de los 10 minutos de observación (Fig. S3), los machos expuestos al ozono exhibieron una latencia de apareamiento más larga que los machos de control (es decir, necesitaron más tiempo para ser aceptados por la hembra; Fig. 2a). . Nuestros resultados indican que los machos expuestos al ozono eran menos atractivos para las hembras cortejadas, lo que se corresponde bien con la reducción de feromonas antes mencionada tras la exposición al ozono. No observamos ningún efecto del ozono cuando las moscas estuvieron expuestas solo durante 15 minutos, mientras que la latencia de apareamiento de los machos nuevamente aumentó después de la exposición al ozono durante dos horas o después de la exposición a niveles más altos de ozono (150 ppb y 200 ppb) (Fig. S4). Curiosamente, después de estar expuestos al ozono durante 2 h, los machos no recuperaron su perfil químico original ni su atractivo para las hembras después de 1 día, pero exhibieron niveles de feromonas y atractivo normales después de 5 días (Fig. S5).

a Latencia del cortejo macho/hembra y latencia de apareamiento después de la exposición del macho a diferentes niveles de ozono (tamaño de la muestra entre paréntesis, prueba de Dunnett para comparaciones múltiples con el control del aire ambiente; grupos que difieren significativamente del control: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). b Comportamiento de cortejo entre machos después de que ambos machos hubieran estado expuestos al ozono. Latencia de cortejo, prueba de Dunnett para comparaciones múltiples; porcentaje de cortejo (porcentaje de experimentos que resultaron en cortejo a machos), prueba exacta de Fisher con corrección de Holm-Bonferroni para comparación múltiple con grupo de control; diferencias significativas con el control descrito como arriba. c Curva dosis-respuesta SSR de la neurona Or67d (at1 sensillum) del macho de D. melanogaster. Panel superior, esquema del procedimiento SSR; los datos se presentan como media ± SE, N = 10 para la exposición al aire o al ozono (prueba t para cada concentración; NS indica que no hay diferencias significativas). El aceite mineral (MO) sirvió como control de disolvente. d Comportamiento de cortejo de un macho intacto de D. melanogaster hacia un macho decapitado. Los machos intactos, los decapitados o ambos fueron expuestos al ozono antes del ensayo de cortejo. Porcentaje de cortejo (ver arriba), prueba exacta de Fisher con corrección de Holm-Bonferroni para comparación múltiple; índice de cortejo (cantidad de tiempo que el macho intacto cortejó durante el experimento), prueba de Tukey para comparaciones múltiples. e La preferencia de una mosca macho por un macho o una hembra decapitados. El macho decapitado, la hembra o ambas moscas decapitadas estuvieron expuestos al ozono antes del ensayo de cortejo. Primera opción presentada en gráficos circulares (prueba exacta de Fisher); Índice de preferencia (tiempo de cortejo a la mujer – tiempo de cortejo al hombre) / tiempo total de cortejo, prueba t no apareada para preferencia de cortejo. Todas las pruebas son de dos colas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Como se mencionó anteriormente, las feromonas específicas masculinas a menudo no sólo funcionan como afrodisíacos para las mujeres sino que también ayudan a los hombres a discriminar sexos6,7. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la exposición al ozono de las moscas macho, con la consiguiente reducción de sus feromonas específicas para los machos, impediría la discriminación sexual. Sin embargo, cuando expusimos a grupos de machos a 100 ppb de ozono, los resultados superaron nuestras expectativas. Después de un breve período (17,72 ± 1,83 min, N = 10) de exposición, los machos comenzaron a cortejarse intensamente entre sí y a exhibir un comportamiento de encadenamiento (película suplementaria S1 y S2), es decir, formaron una larga cadena de machos cortejando que fue primero descrito para machos portadores de una mutación infructuosa, es decir, una mutación en el gen infructuoso que cambia las preferencias de apareamiento de los machos21. Al cuantificar dicho comportamiento de cortejo entre hombres de parejas de machos expuestos al ozono (es decir, 30 minutos a 100 ppb) en un ensayo sin elección (Fig. 2b), de hecho encontramos un mayor número de ensayos que resultaron en un cortejo masculino como en comparación con los machos de control expuestos al aire. Nuevamente, el efecto del ozono podría aumentarse prolongando el tiempo de exposición o aumentando el nivel de ozono (Fig. S6). Como ambos machos estuvieron expuestos al ozono en estos experimentos, nos preguntamos si el aumento observado en el cortejo entre machos se debía únicamente a la degradación de las feromonas específicas de los machos o si además se debía a un posible mal funcionamiento de las neuronas sensoriales responsables de su detección. , debido al estrés oxidativo. Las grabaciones de sensillum único (SSR) de la sensilla tricoidea antenal en 1, conocida por albergar una neurona sensorial olfativa que detecta cVA7, revelaron curvas de dosis-respuesta similares en moscas expuestas al ozono como en moscas de control (Fig. 2c). Además, confrontamos a un macho intacto con un macho decapitado y expusimos a cada uno de ellos al ozono o al aire ambiente antes del encuentro. Descubrimos que el hecho de que el macho intacto exhibiera o no un comportamiento de cortejo no estaba influenciado por su propia exposición al ozono, sino solo por la exposición del macho decapitado (Fig. 2d). En resumen, la exposición al ozono no impide la función de las neuronas que responden a las feromonas u otros niveles de procesamiento de señales, sino que induce el cortejo entre hombres a través de la degradación de las feromonas. A continuación, preguntamos si la exposición al ozono impide por completo la discriminación sexual y analizamos la preferencia de cortejo de los hombres no expuestos al ozono hacia un hombre y una mujer decapitados en un ensayo de elección. Antes de la prueba, las moscas decapitadas fueron expuestas al ozono o al aire de control. Si bien los machos cortejaron preferentemente a las hembras en el experimento de control, la exposición al ozono de las moscas decapitadas resultó en un cortejo igualitario de moscas hembras y machos (Fig. 2e). Curiosamente, cuando solo el hombre decapitado estuvo expuesto al ozono antes del experimento, la mujer decapitada todavía fue cortejada preferentemente en el ensayo de elección (Fig. 2e), lo que sugiere que los químicos específicos de las mujeres son suficientes para la discriminación sexual. Como la exposición de ambos sexos al ozono impidió la discriminación sexual, también las señales femeninas parecen ser sensibles a la degradación por el ozono. De hecho, al analizar mujeres expuestas al ozono (es decir, 2 h a 100 ppb), encontramos cantidades reducidas de los compuestos descritos específicos de mujeres 7,11-heptacosadieno (7,11-HD) y 7,11-nonacosadieno (7, 11-ND) 22,23 (Figura S7).

Habiendo demostrado que la exposición al ozono no sólo reduce el atractivo de un macho de D. melanogaster (CS) hacia las hembras sino que también compromete fuertemente la discriminación sexual, nos preguntamos si este efecto es específico de D. melanogaster (CS) o aparece en otras especies como Bueno. Con base en nuestro estudio anterior sobre compuestos específicos de machos en 99 especies de Drosophila11, seleccionamos otras 8 especies de Drosophila que se sabe que portan compuestos específicos de machos. Expusimos a sus machos durante 2 horas a 100 ppb de ozono y comparamos sus perfiles químicos y comportamiento con los de los machos de control. Siete de estas especies, excepto D. buskii, exhibieron cantidades reducidas de compuestos específicos de los machos después de la exposición al ozono (Fig. 3). Al mismo tiempo, todos mostraron una disminución del éxito de apareamiento y/o cambios en las interacciones entre machos (Fig. 3). Los compuestos específicos de machos descritos por D. busckii no contienen dobles enlaces carbono-carbono y, por lo tanto, son menos sensibles a la degradación por el ozono (Fig. 3). Aunque también se han demostrado los efectos degradantes del ozono sobre los hidrocarburos cuticulares de las moscas que carecen de dobles enlaces de carbono, esos experimentos se realizaron con concentraciones de ozono que, con 45.000 ppm, eran alrededor de 106 superiores a las utilizadas en nuestros experimentos24. El hecho de que los machos de D. buskii tuvieran aún menos éxito cortejando a las hembras podría deberse a compuestos adicionales, no identificados pero sensibles al ozono, que rigen el comportamiento de cortejo en esta especie. Curiosamente, ambas subespecies de D. mojavensis analizadas, a diferencia de las otras especies, mostraron una disminución del cortejo entre machos después de la exposición al ozono. Nuevamente, compuestos adicionales a los descritos para estas subespecies10,11 podrían explicar estos resultados. Finalmente probamos D. suzukii, una especie que no exhibe ningún compuesto específico del sexo y cuyo comportamiento se supone que está más bien impulsado visualmente11,25. Como se esperaba, ni el éxito del apareamiento ni el cortejo entre machos se vieron afectados por el tratamiento con ozono (Fig. 3).

a Los datos representan áreas de pico normalizadas de feromonas en moscas expuestas al ozono y de control (prueba t no apareada de dos colas; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). b, c Efecto sobre el éxito del apareamiento (es decir, porcentaje de experimentos que resultan en apareamiento) y efecto sobre el comportamiento de cortejo entre hombres (es decir, porcentaje de experimentos que resultan en cortejo entre hombres). Prueba exacta de Fisher de dos colas, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se ha demostrado que contaminantes como el ozono y los óxidos nítricos degradan los volátiles florales y, por lo tanto, corrompen la comunicación química entre las plantas y sus insectos polinizadores26,27,28,29,30,31,32. Aquí mostramos que el ozono también puede dañar a los insectos en otro contexto. La exposición de las moscas a niveles de ozono bastante leves, que ya se han informado en áreas contaminadas, degrada sus feromonas insaturadas y, por lo tanto, afecta la comunicación sexual en 9 de cada 10 especies de Drosophila analizadas. Los dobles enlaces de carbono, sin embargo, no son específicos de las feromonas de Drosophila, pero son una característica importante de la mayoría de las feromonas de insectos identificadas33. Como, por ejemplo, muchas hembras de lepidópteros utilizan feromonas para atraer a los machos a largas distancias, los contaminantes oxidantes tienen tiempo suficiente para degradar potencialmente la señal antes de que llegue al receptor. Si bien hoy en día el efecto perjudicial de los pesticidas sobre las poblaciones de insectos está bien establecido en todo el mundo34,35, los insectos obviamente enfrentan un segundo problema: la degradación de sus canales de información química por mayores niveles de contaminantes oxidantes.

Las moscas de tipo salvaje utilizadas en este estudio se obtuvieron del Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC; https://bdsc.indiana.edu/index.html), National Drosophila Species Stock Center (NDSSC; http://blogs.cornell. edu/drosophila/) y el centro de valores de Kioto (Kyoto DGGR; https://kyotofly.kit.jp/cgi-bin/stocks/index.cgi). Los números de stock son los siguientes: D. putrida (15081–1401.00 / 15100–1711.01), D. repletoides (E-17001), D. funebris (15120–1911.05), D. pallidipennis (15210–2331.02), D. saltans (14028–0571.00 / 15250–2451.01), D. moj. wrigleyi (15081–1352,22), D. moj. mojavensis (15081–1352.47), D. busckii (1300–0081.00), D. suzukii (14029–0011.01 / 14011–0131.04). Para experimentos con D. melanogaster utilizamos la cepa de tipo salvaje Canton-S (CS). Todas las moscas se criaron a 25 °C, 12 h de luz: 12 h de oscuridad y 70% de humedad relativa. A excepción de D. melanogaster (CS), todas las demás especies de moscas se criaron con alimento estándar mezclado con plátano. Las vírgenes se recolectaron utilizando anestesia con CO2. Se probaron moscas vírgenes de 10 días en el ámbito del cortejo. El cuidado y tratamiento de todas las moscas cumplió con todas las normas éticas pertinentes.

Sintetizamos compuestos de mosca que incluyen (Z)-10-Heptadecen-2-ona (Z10-17:2Kt), acetato de (Z)-11-Hexadecen-1-ilo (Z11-16:Ac), acetato de rac-2-tridecilo. (13:2Ac), acetato de rac-2-pentadecilo (15:2Ac), acetato de (Z)-11-Eicosen-1-ilo (Z11-20:Ac), acetato de (Z)-10-heptadecen-2-ilo (Z10-17:2Ac) como se describe11. Otros productos químicos, incluido el acetato de cis vancenilo (cVA), (Z)-7-tricoseno (7-T), (Z)-9-tricoseno (9-T), (Z)-7-pentacoseno (7-P) y (Z) -9-Pentacoseno (9-P) se adquirieron en alta pureza de Sigma-Aldrich y Cayman Chemical.

(Z) -11-Pentacoseno (11-P) se sintetizó mediante la reacción de Wittig a partir de bromotetradecano (Sigma-Adrich, Alemania) y undecanal (Sigma-Aldrich, Alemania). Se disolvieron bromotetradecano (1 g, 3,6 mmol) y trifenilfosfina (946 mg, 3,6 mmol) en 20 ml de tolueno y se calentaron a reflujo durante 20 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, se eliminó cuidadosamente la fase de tolueno con una pipeta. El residuo se agitó durante 5 minutos con tolueno fresco (10 ml cada uno), antes de que el tolueno se eliminara con una pipeta nuevamente. Este proceso se repitió tres veces con tolueno y una vez con dietiléter (10 ml). El residuo altamente viscoso se secó en alto vacío durante la noche para obtener la sal de Wittig en forma de un sólido amorfo de color blanquecino.

En atmósfera de argón, se disolvió/suspendió la sal de Wittig (600 mg, 1,11 mmol) en THF anhidro (20 ml) y se enfrió a -30 °C. Se añadió gota a gota una solución de bis(trimetilsilil)amida sódica (1,2 ml, 1 M en THF) y la mezcla se dejó calentar hasta -10 °C. Después de agitar durante 30 minutos, la suspensión ahora de color naranja intenso se enfrió nuevamente a -30 °C antes de agregar undecanal (0,23 ml, 1,11 mmol) mediante una jeringa. La mezcla se agitó durante la noche a 20ºC. La mezcla de reacción se diluyó con n-hexano (20 ml) antes de añadir agua (40 ml). Se eliminó la fase orgánica y la fase acuosa se extrajo con n-hexano (2 x 40 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera (40 ml cada una) y se secaron sobre Mg2SO4. Después de la filtración, el disolvente se eliminó mediante rotavapor, el residuo se adsorbió en gel de sílice y se cromatografió con n-hexano/EtOAc (50:1) como eluyente para obtener (Z)-11-pentacoseno (130 mg, 34 % de rendimiento basado en undecanal). como un aceite incoloro.

Sistema de exposición al ozono, consulte la Fig. S1. Se usó aire ambiente comprimido (con 4,5 ± 0,5 ppb de ozono) para producir aire de control (es decir, aire ambiente humidificado a 70% de humedad relativa), aire limpio (es decir, aire que mediante un depurador de ozono de paladio se limpió de todo el ozono natural). y aire enriquecido con ozono (es decir, aire ambiental conducido a través de un generador de ozono (Aqua Medic, Alemania) que podía producir hasta 100 mg de ozono/h). Humedeciendo y mezclando aire limpio con ozono enriquecido en la caja de mezcla, se podrían producir diferentes niveles de aire experimental ozonizado. La concentración de ozono se podía aumentar (disminuir) disminuyendo (aumentando) el caudal a través del controlador de flujo másico antes del depurador de ozono (por ejemplo, 5 l/min), mientras que el caudal a través del generador de ozono se mantenía constante en 0,7 l/min. . Como las concentraciones de ozono cambian cuando el aire se humidifica, el aire experimental ozonizado se almacenó dinámicamente en una caja de mezcla (un contenedor de plexiglás de 100 L), desde donde se sondeó continuamente el aire para el monitor de ozono (BMT 932, BMT Messtechnik GmbH, Alemania), mientras Al mismo tiempo, se condujeron 0,2 l/min de cada uno a los cuatro viales de plástico de 70 ml que contenían las moscas y se limpió el exceso de aire del ozono mediante un depurador de ozono de paladio adicional antes de liberarlo al aire de la cámara. Se conectó un segundo conjunto de cuatro viales de 70 ml al flujo de aire ambiente para producir "moscas de control" para el experimento. Todo el sistema se construyó dos veces con una válvula que cambiaba el aire enriquecido con ozono entre las dos configuraciones para poder preparar en paralelo otro conjunto de moscas experimentales y de control. Por ejemplo, abriendo la válvula 5 s hacia la izquierda y 10 s hacia la derecha, se podrían realizar experimentos con diferentes concentraciones de ozono en paralelo.

Para analizar los perfiles químicos de las moscas en los experimentos TDU GC-MS, primero se expusieron moscas de 10 días de edad al ozono o al aire de control durante un tiempo determinado y luego se congelaron inmediatamente a -20 °C durante 30 minutos. Para investigar la recuperación de los perfiles químicos después de la exposición al ozono, los machos fueron expuestos a 100 ppb de ozono durante 2 horas y luego fueron trasladados a tubos con comida estándar durante 1 o 5 días. Luego fueron congelados como se mencionó anteriormente. Para las mediciones de TDU GC-MS, se colocaron moscas individuales en microviales de tubos de desorción térmica (GERSTEL, Alemania) y se agregaron a los microviales 0,5 µl de C10-Br o C16-Br (dilución 10-3 en hexano) como estándar interno.

Los tubos de desorción se transfirieron utilizando un muestreador multipropósito GERSTEL MPS 2 XL a una unidad de desorción térmica GERSTEL (GERSTEL, Alemania). Las muestras se desorbieron a 250 °C durante 8 minutos y luego se atraparon a -50 °C en el revestimiento de un sistema de inyección enfriado GERSTEL CIS 4, usándose nitrógeno líquido para enfriar. Los componentes se transfirieron a la columna de GC calentando el inyector del vaporizador de temperatura programable a 12 °C/s hasta 270 °C y luego manteniendo la temperatura durante 5 min. El GC-MS (Agilent GC 7890A equipado con una unidad MSD XL inerte MS 5975 C; Agilent Technologies, EE. UU.) estaba equipado con una columna HP5 (Agilent Technologies, EE. UU.). La temperatura del horno de cromatografía de gases se mantuvo a 50 °C durante 3 min y luego se aumentó en 15 °C/min hasta 230 °C y luego en 20 °C/min hasta 280 °C, mantenida durante 20 min. Los espectros de masas se tomaron en modo EI (a 70 eV) en el rango de 33 m/z a 500 m/z.

Se recolectaron machos y hembras vírgenes de todos los drosofílidos analizados después de la eclosión y se criaron individualmente y en grupos (20 individuos/vial), respectivamente. Para los ensayos de cortejo entre hombres y mujeres, se expuso a 15 machos al ozono o al aire ambiente en un vial. Luego se colocó a un macho individual tratado con ozono con una hembra no tratada en una cámara de cortejo y se observó y cuantificó su comportamiento durante 1 h. Cada arena de cortejo contenía 4 cámaras (1 cm de diámetro x 0,5 cm de profundidad) cubiertas con un tobogán de plástico. Se registraron cuatro cámaras simultáneamente. Se añadió un flujo de aire de 0,2 ml/min desde abajo a cada arena. Se utilizó una cámara GoPro 4 o Logitech C615 para registrar los comportamientos de cortejo. Cada video fue analizado manualmente para determinar la latencia de cortejo (es decir, el tiempo hasta que el macho inició el comportamiento de cortejo), el porcentaje de cortejo (es decir, el porcentaje de machos que mostraron comportamiento de cortejo), el índice de cortejo (es decir, el tiempo que cada macho realizó el comportamiento de cortejo durante el 10 min de tiempo experimental), latencia de apareamiento (es decir, el tiempo hasta que comenzó el apareamiento exitoso) y éxito del apareamiento (es decir, el porcentaje de machos que copularon). Todos los experimentos de comportamiento se realizaron a 25 °C y 70% de humedad.

Para los ensayos de cortejo entre machos, se expuso a 25 machos al ozono o al aire ambiente en un tubo para moscas. Posteriormente, se colocaron dos machos en una cámara y se observaron y cuantificaron sus comportamientos durante 30 minutos. Para D. melanogaster (CS), se probaron varias combinaciones de exposición al ozono (es decir, 15 min, 30 min y 2 h con 50, 100, 150 y 200 ppb, respectivamente). Los machos de otros drosofílidos fueron expuestos durante 2 h a 100 ppb. Para los ensayos sin elección con machos decapitados, los machos fueron expuestos al ozono y luego decapitados. Se colocaron un macho intacto y un macho decapitado en una cámara y se observó y cuantificó el comportamiento de cortejo del macho intacto durante 30 minutos. Para los ensayos de dos opciones con moscas decapitadas, se expusieron machos y/o hembras al ozono y luego se decapitaron. Un hombre intacto y un hombre y una mujer decapitados fueron colocados en una cámara. El índice de preferencia del macho intacto que cortejaba se calculó como (tiempo que tarda un macho intacto en cortejar a una hembra decapitada; el tiempo que tarda un macho intacto en cortejar a un macho decapitado)/30 min.

Se expusieron moscas macho de D. melanogaster (CS) al ozono o al aire ambiente y luego se inmovilizaron en la punta de una pipeta. Se colocó un electrodo de referencia en el ojo; Se insertó otro electrodo de tungsteno en el sensillum objetivo. El at1 se identificó en función de su ubicación y actividades espontáneas. Las señales se amplificaron mediante Syntech Universal AC/DC Probe (Syntech, Alemania), se muestrearon (96.000,0 muestras/s) y se filtraron (500–5000 Hz con supresión de 50/60 Hz) a través de una conexión USB-IDAC (Syntech, Alemania) a un ordenador. Los potenciales de acción se extrajeron utilizando el software AutoSpike (Syntech, Alemania). Los compuestos sintéticos se diluyeron en aceite mineral (MO) (Sigma-Aldrich, Alemania). Antes de la prueba, se cargaron 10 µl del olor diluido en un pequeño trozo de papel de filtro (1 cm2) y se colocaron dentro de una pipeta Pasteur de vidrio. Las dosis de olor probadas oscilaron entre 10-5-10-1 dilución (v/v). El olor se administró insertando la punta de la pipeta en una corriente de aire constante y humidificada que fluía a 600 ml/min a través de un tubo de acero inoxidable (diámetro, 8 mm) que terminaba a 1 cm de distancia de la antena. La actividad neuronal se registró durante 10 s, comenzando 3 s antes del período de estimulación de 0,5 s. Las respuestas de las neuronas individuales se calcularon como el aumento (o disminución) en la frecuencia del potencial de acción (picos/s) en relación con la frecuencia previa al estímulo. Las trazas se procesaron clasificando las amplitudes de los picos en AutoSpike, análisis en Excel e ilustración en Adobe Illustrator CS (sistemas Adobe, EE. UU.).

Los análisis estadísticos (ver las leyendas correspondientes de cada figura) y las cifras preliminares se realizaron utilizando GraphPad Prism v. 8 (GraphPad Software, EE. UU.). Luego las figuras fueron procesadas con Adobe Illustrator CS5.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados en este estudio se proporcionan en el archivo de datos fuente. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a I. Alali y S. Trautheim por su ayuda con la cría de moscas. Esta investigación fue apoyada mediante financiación de la Sociedad Max Planck y específicamente mediante financiación del Centro Max Planck “Ecología química de insectos de próxima generación”.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Estos autores contribuyeron igualmente: Bill S. Hansson, Markus Knaden.

Departamento de Neuroetología Evolutiva, Instituto Max Planck de Ecología Química, Hans-Knöll-Straße 8, D-07745, Jena, Alemania

Nan-Ji Jiang, Hetan Chang, Kerstin Weniger, Bill S. Hansson y Markus Knaden

Ecología química de insectos de próxima generación, Centro Max Planck, Instituto Max Planck de Ecología Química, Hans-Knöll-Straße 8, D-07745, Jena, Alemania

Nan-Ji Jiang, Bill S. Hansson y Markus Knaden

Grupo de Investigación en Espectrometría de Masas/Proteómica, Instituto Max Planck de Ecología Química, Hans-Knöll-Straße 8, D-07745, Jena, Alemania

Jerrit Weissflog

Instituto Max Planck de Ecología Química, Hans-Knöll Straße 8, D-07745, Jena, Alemania

Franziska Eberl y Daniel Veit

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NJ.J., BSH y MK diseñaron el plan de investigación y NJ.J. realizó la mayoría de los experimentos. HC realizó experimentos SSR. FE y DV construyeron el dispositivo de exposición al ozono. NJ.J y KW analizaron y cuantificaron compuestos de feromonas. JW sintetizó compuestos sintéticos. Nueva Jersey. analizaron datos experimentales. NJ.J., BSH y MK escribieron el artículo. Todos los autores editaron el manuscrito.

Correspondencia a Markus Knaden.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Sylvia Anton y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Jiang, Nueva Jersey, Chang, H., Weißflog, J. et al. La exposición al ozono interrumpe la comunicación sexual de los insectos. Nat Comuna 14, 1186 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36534-9

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Recibido: 28 de octubre de 2022

Aceptado: 06 de febrero de 2023

Publicado: 14 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36534-9

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