Establecimiento de una materia particulada artificial.

Jun 15, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 5955 (2023) Citar este artículo

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Las partículas en suspensión (PM), un factor de riesgo ambiental, están relacionadas con riesgos para la salud, como las enfermedades respiratorias. Este estudio tuvo como objetivo establecer un modelo animal de lesión pulmonar inducida por PM con PM artificial (APM) e identificar el potencial del APM para la investigación toxicológica. APM se generó a partir de grafito a 600 °C y se combinó con etileno. Analizamos las composiciones de partículas de escape de diésel (DEP) y APM y comparamos la toxicidad y el perfil transcriptómico en los pulmones según la exposición. Para el estudio con animales, a ratones macho C57BL/6 se les administró por vía intratraqueal vehículo, DEP o APM. DEP o APM aumentaron el peso pulmonar relativo, el número de células inflamatorias y los niveles de proteínas inflamatorias en comparación con el control del vehículo. Las evaluaciones histológicas mostraron un aumento en los macrófagos alveolares de partículas de pigmento y una ligera inflamación en los pulmones de los ratones DEP y APM. En el único grupo de APM, se observaron inflamación granulomatosa, fibrosis pulmonar e hiperplasia mucosa en los pulmones de algunos individuos. Este es el primer estudio que compara la toxicidad pulmonar entre DEP y APM en un modelo animal. Nuestros resultados sugieren que el modelo animal tratado con APM puede contribuir a comprender los efectos nocivos del PM en estudios toxicológicos que muestran que el APM puede inducir diversas enfermedades pulmonares según diferentes dosis de APM.

En 2013, la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer de la Organización Mundial de la Salud clasificó las partículas en suspensión (PM) como carcinógeno del grupo 1. PM es una mezcla compleja de sustancias orgánicas e inorgánicas sólidas y/o líquidas suspendidas en el aire, que incluye carbono orgánico (OC), carbono elemental (EC), hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH), iones orgánicos solubles en agua (cloruro, nitrato , sulfato, sodio, potasio y amonio) y metales en la atmósfera natural2. Las fracciones de PM difieren en sus propiedades físicas y biológicas según la estación, la región y las fuentes3,4,5,6,7. Se producen altas concentraciones de OC, CE y HAP durante las estaciones cálidas en zonas de mucho tráfico y durante la noche8,9. En términos de efectos sobre la salud, la exposición a PM, incluidos los OC, AE y HAP en el aire ambiente, induce y exacerba los síntomas clínicos de enfermedades pulmonares, hepáticas, renales y cardíacas8,10,11,12,13,14,15. La mayoría de las investigaciones se han centrado en estudios epidemiológicos, que muestran una relación entre los contaminantes del aire y las visitas a las salas de emergencia y los ingresos hospitalarios. Actualmente, se necesitan investigaciones toxicológicas, como estudios in vivo e in vitro, para probar posibles efectos tóxicos en humanos y especular sobre los mecanismos relacionados. Muchos investigadores han utilizado el material de referencia estándar 2975 (SRM2975, partículas de escape diésel, DEP) como componente de las PM para estudiar los riesgos para la salud asociados con la exposición a las PM. El DEP lo emiten los montacargas industriales e incluye HAP, nitro-HAP, derivados oxigenados de HAP, compuestos heterocíclicos, aldehídos e hidrocarburos alifáticos16,17. Sin embargo, existen algunas limitaciones en los estudios toxicológicos sobre la exposición a PM. Se requieren altas cantidades de DEP para probar la toxicidad pulmonar, como la toxicidad por inhalación por exposición a PM, especialmente en altas concentraciones.

Esto genera altos costos para los estudios sobre los efectos a largo plazo de la exposición a PM. Además, entre diversas fuentes, se pueden realizar estudios toxicológicos de PM centrándose únicamente en la toxicidad de DEP.

En este estudio, sintetizamos PM artificial (APM) en un laboratorio para usar en lugar de partículas de escape diésel (DEP) en estudios toxicológicos. Analizamos la relación OC/EC y HAP entre DEP y APM, comparamos las características patológicas del sistema respiratorio y realizamos análisis transcriptómicos de los pulmones después de la exposición a APM y DEP a través de la ruta intratraqueal en un estudio in vivo para evaluar el potencial de APM. para uso en estudios toxicológicos respiratorios.

Nuestro estudio anterior caracterizó los tamaños de partículas y la morfología de DEP y APM. DEP y APM son generalmente menores de 600 nm y 30 nm, respectivamente18,19. El DEP es esférico y está compuesto de aglomerados irregulares, y el APM exhibió morfologías típicas de partículas de hollín diésel18,19. En el presente estudio, medimos la relación OC/EC y los HAP para identificar y comparar las composiciones de DEP y APM. Las relaciones OC/EC de DEP y APM fueron 1,52 y 1,23, respectivamente (Fig. 1A). Las concentraciones de los siete HAP se midieron utilizando DEP y APM. Las concentraciones de fenantreno, antraceno, fluoranteno, pireno, benzo[a]pireno, indeno[1,2,3-cd]pireno y benzo[g,h,i]perileno fueron 6,42, 1,27, 12,01, 1,56, 0,14, 0,20. y 0,14 μg/mL en DEP y 137,49, 8,00, 22,76, 9,56, 0,17, 0,50 y 0 μg/mL en APM, respectivamente. Las concentraciones de fenantreno, antraceno, fluoranteno y pireno fueron aproximadamente de 1,89 a 21,43 veces mayores en el APM que en el DEP.

Composiciones en DEP y APM. (A) relación OC/EC y (B) concentración de PAH en DEP y APM. Los datos representan la media ± DE (n = 3). Carbono orgánico OC, carbono elemental EC, hidrocarburos aromáticos policíclicos PAH, partículas de escape diésel DEP, partículas artificiales APM.

No hay cambios en el peso corporal en el grupo VC. En los grupos DEP y APM, se observó una reducción del peso corporal. Especialmente, en los grupos de APM, hay una reducción significativa del peso corporal (Fig. 2A). El peso pulmonar relativo aumentó estadísticamente de manera dependiente de la dosis en los grupos DEP y APM en comparación con el grupo VC (Fig. 2B). El peso pulmonar relativo fue mayor en el grupo APM que en el grupo DEP. Sin embargo, no hubo diferencias en los pesos relativos del timo y el bazo en los grupos DEP y APM en comparación con los ratones VC (Fig. 2C, D).

Cambios en (A) el peso relativo del cuerpo y (B – D), (E) la población de células, (F – J) las células inflamatorias absolutas y (K – O) la producción de diversas citocinas inflamatorias en el BALF del vehículo. Ratones instilados con DEP y APM. Los pesos de los órganos se calcularon mediante la siguiente fórmula: peso relativo de los órganos = peso de los órganos (g)/peso corporal terminal (g) × 100%. Los datos representan la media ± DE (n = 4 o 5 por grupo). #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 o ####p < 0,0001 frente a VC. Partículas de escape diésel DEP, partículas artificiales APM, líquido de lavado broncoalveolar BALF, desviación estándar SD.

Determinamos si DEP y APM causaron inflamación pulmonar y comparamos la proporción y el número de células inflamatorias en BALF después de la exposición a DEP y APM. Primero, medimos la proporción de células inflamatorias en el BALF de ratones. Los macrófagos se observaron principalmente en el grupo control, representando el 97,75% del total de células. Sin embargo, se observó comúnmente una disminución en la proporción de macrófagos y un aumento en la de neutrófilos en los grupos DEP y APM. Además, las proporciones de eosinófilos y linfocitos aumentaron ligeramente tras la exposición a DEP y APM. En particular, la proporción de eosinófilos fue mayor en el grupo de APM que en el grupo de DEP en todas las dosis (Fig. 2E). Estos resultados indicaron que DEP y APM indujeron cambios celulares y respuestas inflamatorias en los pulmones.

En segundo lugar, el número absoluto de células inflamatorias se calculó dividiendo la proporción de células inflamatorias por el número de células totales. En relación con el grupo de control, el número de células totales y células inflamatorias como macrófagos y neutrófilos, eosinófilos y linfocitos en BALF aumentó en los grupos instilados con DEP o APM (Fig. 2F-J). A excepción de los eosinófilos, el número de células totales, macrófagos, neutrófilos y linfocitos en el BALF del grupo DEP aumentó gradualmente de forma relacionada con la dosis. Aunque no se observó dependencia de la dosis para el aumento en el número de células totales y varias células inflamatorias en el BALF del grupo APM, estas fueron mayores en el grupo APM que en el grupo DEP en todas las dosis. En particular, el número de eosinófilos aumentó significativamente sólo en el grupo APM. Estos resultados indicaron que, aunque la proporción y el número de células inflamatorias en BALF infiltradas por la exposición a DEP y APM diferían ligeramente, tanto DEP como APM iniciaron y mantuvieron respuestas inflamatorias mediante la infiltración de células inflamatorias mixtas en los pulmones de ratones.

Evaluamos los niveles de varias citocinas inflamatorias en el BALF de ratones instilados con DEP o APM. DEP y APM indujeron un aumento en los niveles de varias citocinas inflamatorias, como la interleucina (IL) -5, IL-6, el factor de necrosis tumoral (TNF) -α, la proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1) y el motivo CXC. receptor de quimiocina 1 (CXCL1) / KC en BALF en relación con VC (Fig. 2K-O). Aunque no hubo diferencias estadísticamente significativas en los niveles de citoquinas inflamatorias, incluidos los de IL-5, IL-6, TNF-α y MCP-1, se observó una tendencia creciente en el grupo de DEP en comparación con el grupo de control. DEP mejoró significativamente solo los niveles de CXCL1/KC en BALF. En el grupo APM, los niveles de citocinas inflamatorias aumentaron significativamente. De acuerdo con los resultados de un aumento en la proporción celular tras la exposición a DEP y APM, la liberación de citoquinas inflamatorias fue más fuerte en el BALF del grupo APM que en el grupo DEP.

Se realizó una evaluación histológica mediante tinción con H&E, MT y PAS para identificar y comparar las características histopatológicas en los tejidos pulmonares de ratones instilados con DEP y APM. Las secciones de pulmón teñidas con H&E revelaron que la instilación de DEP y APM comúnmente resultaba en una acumulación de macrófagos alveolares cargados de partículas (flechas negras) de una manera dependiente de la dosis junto con una ligera inflamación pulmonar (flechas rojas; Fig. 3). En los pulmones de algunos individuos de ratones instilados con APM, se observó inflamación granulomatosa, fibrosis pulmonar e hiperplasia de células mucosas (Fig. 4) mediante tinción con H&E, MT y PAS, respectivamente. Estos hallazgos se confirmaron mediante puntuación histológica de secciones de pulmón (Tabla 1). Estos resultados indicaron que tanto la inflamación pulmonar aguda mediada por macrófagos alveolares inducida por DEP como la exposición a APM podrían conducir a una enfermedad pulmonar más grave en comparación con la exposición a DEP.

Cambios histológicos en los tejidos pulmonares tras la exposición a DEP o APM. Portaobjetos representativos de pulmones teñidos con H&E obtenidos de ratones a los que se les inculcó el vehículo, DEP o APM. Las flechas negras y rojas indican macrófagos alveolares de partículas de pigmento e infiltración de células inflamatorias, respectivamente. Partículas de escape diésel DEP, partículas artificiales APM, hematoxilina y eosina H&E.

Portaobjetos representativos de pulmones teñidos con MT y PAS obtenidos de ratones a los que se les instiló vehículo y APM. La flecha negra indica hiperplasia de células mucosas. Tinción tricrómica de MT Masson, PAS Ácido periódico-Schiff, partículas artificiales APM.

Determinamos perfiles de expresión genética alterados por DEP o APM e identificamos términos de ontología genética (GO) para comparar los cambios relacionados con el daño en la expresión genética inducidos en respuesta al tratamiento con DEP y APM. El perfil transcriptómico mostró patrones diferenciales de expresión genética en los grupos de instilación de DEP y APM y mostró una mayor sensibilidad a las alteraciones genéticas en el último que en el primero. En total, se identificaron 257, 341 y 1794 expresiones diferenciales de genes (DEG) para la exposición a DEP, mientras que se identificaron 849, 1176 y 1842 DEG para la exposición a APM en las tres dosis correspondientes. Entre estos, se identificaron 40 y 400 genes que comúnmente estaban alterados en las tres dosis en la exposición a DEP y APM, respectivamente. Entre estos, se seleccionaron 31 y 242 genes que mostraban cambios de expresión relacionados con la dosis en los grupos DEP y APM, respectivamente. También identificamos 31 genes comúnmente alterados en los grupos de exposición a DEP y APM para identificar nuevos biomarcadores de lesión pulmonar alterada por PM. Los 10 genes principales con los mayores cambios fueron Gpnmb, Trem2, Clec4d, Slc26a4, Ear6, Cxcl5, Slc39a2, Cd300lf, Cxcr1 y Nup62-il4i1. La expresión de nueve genes (Gpnmb, Trem2, Clec4d, Slc26a4, Ear6, Cd300lf, Ctsd, Ptgir y Tacc3) fue mayor en el grupo APM que en el grupo DEP. Los genes modulados estadísticamente en los grupos DEP y APM se clasificaron mediante procesos biológicos (BP) GO, la Enciclopedia de Kyoto para rutas de genes y genomas (KEGG) y análisis de enfermedades para analizar los mecanismos moleculares relacionados con la exposición a PM. En la Tabla 2 se muestran los BP y las vías KEGG clave que cambiaron estadísticamente por DEP y APM (valor p de la prueba exacta de Fisher < 0,05). En general, 17 BP y 5 vías KEGG se enriquecieron estadísticamente en los grupos de exposición a DEP, y 99 BP y 15 vías KEGG se enriquecieron estadísticamente en los grupos de exposición a APM. El análisis GO mostró que los genes alterados por APM estaban relacionados con más BP y vías que los genes alterados por DEP. Los genes alterados por DEP se vincularon principalmente con respuestas inflamatorias, incluida la regulación positiva de la cascada de quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) 1 y ERK2, la respuesta al factor de necrosis tumoral y la vía de señalización de quimiocinas (Tabla 2). Los genes alterados por APM se relacionaron con respuestas inflamatorias, procesos fagocíticos y procesos profibróticos debido a su participación en la regulación de diversas vías de señalización, incluida la regulación positiva de la cascada ERK1 y ERK2, la regulación positiva de NF-kappaB (NF-κB) actividad del factor de transcripción, regulación positiva de la señalización de la proteína quinasa B, regulación positiva de la cascada de proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), respuesta celular al factor de necrosis tumoral, regulación positiva de la fagocitosis, regulación positiva de la proliferación de células del músculo liso, respuesta celular al crecimiento de fibroblastos estímulo del factor y vía de señalización del receptor tipo Toll (Tabla 2).

Finalmente, los genes alterados por PM se analizaron más a fondo utilizando la Base de datos de toxicogenómica comparativa (CTD) para dilucidar las implicaciones de los genes alterados en las enfermedades pulmonares y otros trastornos. Tanto 31 como 242 genes que mostraron cambios en la expresión relacionados con la dosis en los grupos de exposición a DEP y APM, respectivamente, se asociaron con diversas enfermedades relacionadas con el tracto respiratorio, con un mayor número de enfermedades respiratorias asociadas con genes alterados por APM. 31 genes alterados por DEP estaban relacionados con enfermedades del tracto respiratorio, hipersensibilidad respiratoria y enfermedades bronquiales, y 242 genes alterados por APM estaban relacionados con enfermedades del tracto respiratorio, enfermedades pulmonares, neumonía, infecciones del tracto respiratorio, neoplasias pulmonares y neoplasias del tracto respiratorio (Tabla 3). Como se muestra en las Tablas 2 y 3, los números en CTD y genes anotados fueron mayores en el grupo APM que en el grupo DEP. En el análisis transcriptómico, nuestros resultados mostraron que la exposición a APM indujo la expresión de más DEG que la exposición a DEP en los pulmones de los ratones, y una mayor expresión de APM indujo una mayor gravedad de las enfermedades pulmonares al estar involucrado en varios BP que la exposición a DEP.

Las PM, una mezcla compleja de sustancias sólidas y/o líquidas orgánicas e inorgánicas, se consideran un factor de riesgo ambiental. La evidencia acumulada sugiere que la PM está relacionada con enfermedades respiratorias, como la EPOC, el asma, la fibrosis e incluso el cáncer. Actualmente, para estudiar los riesgos para la salud de la exposición a PM en los pulmones, muchos investigadores han utilizado DEP ya que es difícil obtener resultados científicos reproducibles debido a la diversidad de PM por estación, región y fuente. Además, también lleva mucho tiempo recolectar partículas naturales para investigar su toxicidad en estudios con animales y células. Sin embargo, debido a los altos costos asociados con la DEP, la información toxicológica, incluida la toxicidad por inhalación en altas concentraciones durante mucho tiempo, puede ser limitada. Además, excluyendo otros factores, sólo se puede investigar la toxicidad del DEP. Por lo tanto, para superar estas limitaciones asociadas con la DEP, generamos APM, analizamos sus componentes y comparamos los efectos respiratorios en ratones instilados con DEP y APM para confirmar su aplicabilidad a la investigación toxicológica. Además, realizamos un análisis transcriptómico para explicar los cambios patológicos causados ​​por la exposición a DEP y APM en ratones.

Seleccionamos DEP, que ha sido ampliamente utilizado en estudios toxicológicos, como componente principal de PM2,5. En un estudio anterior, comparamos el tamaño de las partículas y la morfología entre DEP y APM. APM es más pequeño que el tamaño de DEP18,19. DEP y APM son esféricos y están compuestos de aglomerados irregulares y morfologías típicas de partículas de hollín diésel, respectivamente18,19.

En primer lugar, en este estudio analizamos los HAP y los ratios OC/EC en APM y DEP. Los HAP y los ratios OC/EC están asociados con la inducción y exacerbación de enfermedades pulmonares8,9,10,11,12,13,14,15. Nuestros resultados mostraron que los niveles de PAH eran más altos en APM que en DEP, y la relación OC/EC fue similar entre DEP y APM (Fig. 1). Los HAP emitidos por fuentes antropogénicas en el aire ambiente se clasifican como cancerígenos o probablemente cancerígenos para los seres humanos en la IARC. Los HAP ambientales se asocian con el desarrollo de cáncer de pulmón20,21,22,23,24 y con efectos no cancerígenos como disminución de la función pulmonar, exacerbación del asma y aumento de la morbilidad y mortalidad de las enfermedades pulmonares obstructivas25,26,27. Nuestra hipótesis es que el APM podría causar enfermedades pulmonares con mayor gravedad que el DEP, según el tamaño de las partículas y la proporción de HAP. En este estudio, realizamos un estudio en animales para identificar y comparar los efectos respiratorios de DEP midiendo el peso corporal durante el período experimental, el peso de los órganos, los cambios celulares, los niveles de citocinas inflamatorias en BALF y los cambios histológicos en los pulmones de DEP o Ratones instilados con APM. Anteriormente hemos demostrado que la DEP indujo inflamación pulmonar neutrofílica dominante en un grupo al que se le instiló 100 μg/ratón (5 mg/kg) de DEP28,29,30. En base a esto, se seleccionó la dosis más alta de DEP y APM como 5 mg/kg. En este estudio, los ratones fueron expuestos por vía intratraqueal a DEP y APM. En el grupo instilado con DEP o APM, se observó un aumento significativo del peso pulmonar relativo en comparación con el del grupo VC (Fig. 2). El aumento del peso pulmonar indica un aumento de la permeabilidad vascular y la infiltración de células inflamatorias en los sitios pulmonares lesionados31. En este estudio, aunque estadísticamente se infiltraron eosinófilos en BALF del único grupo de APM, la proporción de diversas células inflamatorias como macrófagos, neutrófilos y linfocitos aumentó significativamente en BALF de ratones instilados con DEP y APM (Fig. 2). . Estos resultados pueden estar relacionados con el aumento del peso pulmonar de los ratones a los que se les instiló DEP o APM. También verificamos varias proteínas inflamatorias en el BALF de ratones instilados con DEP y APM. ELISA mostró que los niveles de citocinas inflamatorias como IL-6, TNF-α, MCP-1 y CXCL1/KC en BALF aumentaron en BALF de ratones instilados con DEP y APM. Estos niveles de proteína fueron particularmente más altos en el BALF de ratones expuestos a APM que a los expuestos a DEP (Fig. 2). El nivel de proteína de IL-5 aumentó gradualmente en los grupos BALF de DEP sin ningún cambio estadísticamente significativo, mientras que este nivel aumentó significativamente solo en el grupo APM. MCP-1 es una quimiocina clave que desempeña un papel crucial en la regulación de la migración y el reclutamiento de monocitos/macrófagos32. La IL-6 y el TNF-α se liberan de los macrófagos alveolares pigmentados con PM y participan en las respuestas inflamatorias33. MCP-1, IL-6 y TNF-α son quimiocinas o citocinas clave implicadas en enfermedades pulmonares, incluidas el asma y la EPOC. La quimiocina CXCL1/KC desempeña un papel crucial en la inflamación aguda, ya que es el principal quimioatrayente responsable del reclutamiento de neutrófilos. La IL-5 producida a partir de células CD4+ Th2, mastocitos, eosinófilos y basófilos es el modulador más potente de la acumulación de eosinófilos durante respuestas alérgicas como el asma34. De acuerdo con estos resultados, en las evaluaciones histológicas, se observó comúnmente infiltración de células inflamatorias mixtas en las regiones perivasculares en los pulmones de los grupos DEP y APM (Fig. 3, Tabla 1). Sin embargo, se observaron inflamación granulomatosa, fibrosis pulmonar e hiperplasia mucosa en algunos ratones de los únicos grupos de APM (Fig. 4, Tabla 1). Estos resultados indicaron que tanto DEP como APM indujeron inflamación pulmonar acompañada de infiltración de células inflamatorias mixtas, que pueden inducir una lesión pulmonar más grave que DEP según la gravedad de la infiltración de células inflamatorias y los niveles de citoquinas.

A continuación, identificamos los patrones de expresión genética en los pulmones expuestos a DEP y APM para comprender los cambios asociados a lesiones en la expresión genética y los mecanismos relacionados y nos centramos en la expresión genética y el análisis GO para dilucidar los cambios patológicos comunes y las diferentes gravedades de las lesiones pulmonares en DEP. - o ratones instilados con APM. Descubrimos que los cambios transcriptómicos causados ​​por la exposición a APM eran mucho más sensibles que los debidos a la exposición a DEP, induciendo la expresión de 242 y 31 genes, respectivamente, de manera dosis dependiente. Además, identificamos 31 genes comunes anotados por la exposición a DEP y APM para abordar los cambios patológicos comúnmente observados por la exposición a DEP o APM en un modelo in vivo. Los 10 genes principales con los mayores cambios entre los 31 genes comunes en los grupos DEP y APM fueron Gpnmb, Trem2, Clec4d, Slc26a4, Ear6, Cxcl5, Slc39a2, Cd300lf, Cxcr1 y Nup62-il4i1. Entre ellos, nueve genes (Gpnmb, Trem2, Clec4d, Slc26a4, Ear6, Cd300lf, Ctsd, Ptgir y Tacc3) estaban regulados positivamente en el grupo APM en relación con el grupo DEP de una manera dependiente de la dosis. Los nueve genes principales desempeñan funciones importantes en la inflamación pulmonar, el asma, la EPOC, la fibrosis pulmonar y el cáncer de pulmón35,36,37,38,39,40,41,42,43. En este estudio, observamos inflamación pulmonar común en los grupos DEP y APM mediante evaluación histológica, y la gravedad fue mayor en el grupo APM en relación con el grupo DEP. Las características patológicas, incluyendo inflamación granulomatosa, fibrosis pulmonar e hiperplasia de células mucosas, se observaron sólo en los pulmones del grupo APM. Por lo tanto, nuestros resultados indicaron que los niveles alterados de expresión genética podrían influir en la gravedad de la lesión pulmonar inducida por DEP y APM.

Las vías clave de BP y KEGG afectadas significativamente por la exposición a DEP y APM se presentan en la Tabla 2. Los genes alterados por DEP y APM están comúnmente relacionados con respuestas inmunes e inflamatorias, incluidos procesos de oxidación-reducción, angiogénesis y regulación positiva de la cascada ERK1 y ERK2. , quimiotaxis y respuesta celular al factor de necrosis tumoral. Estos cambios en la expresión génica son consistentes con los resultados de los cambios celulares y el análisis de citocinas en BALF, que muestran un aumento en macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, linfocitos y varios niveles de citocinas, incluidas IL-5, IL-6, TNF-α, MCP-1 y CXCL1 (Fig. 2). Los genes se analizaron más a fondo utilizando CTD para dilucidar las relaciones entre genes y enfermedades alteradas por la instilación de DEP y APM dentro de la categoría de enfermedades del tracto respiratorio. De manera dependiente de la dosis, 31 genes comunes en los grupos DEP estaban involucrados en diversas enfermedades relacionadas con el tracto respiratorio (es decir, enfermedades del tracto respiratorio, hipersensibilidad respiratoria y enfermedades bronquiales; Tabla 3), y 242 genes comunes en los grupos APM estaban involucrados. relacionados con diversas enfermedades relacionadas con el tracto respiratorio (es decir, enfermedades del tracto respiratorio, enfermedades pulmonares, neumonía, infecciones del tracto respiratorio, neoplasias de pulmón y neoplasias del tracto respiratorio; Tabla 3). De manera similar a las características patológicas observadas en ratones instilados con DEP o APM, los genes alterados observados en el grupo de APM estuvieron involucrados en más PA y enfermedades en comparación con DEP. Estos resultados indicaron que la exposición a APM es más sensible a los cambios en la expresión genética relacionados con la lesión pulmonar que la exposición a DEP.

Además, analizamos y comparamos las PA clave entre la exposición a DEP y APM, centrándonos en el asma porque las características asmáticas, incluida la infiltración de eosinófilos y el aumento de la producción de IL-5, mejoraron significativamente en el BALF del grupo de APM. Además, se observó hiperplasia mucosa en los pulmones del grupo APM pero no en el grupo DEP. El asma se produce debido a factores genéticos y ambientales como el tabaquismo, diversos alérgenos y contaminantes44 y es una enfermedad pulmonar crónica caracterizada por infiltración de eosinófilos, aumento de la producción de citocinas Th2, aumento de la producción de inmunoglobulina E (IgE) a partir de células B, aumento de los vasos sanguíneos, aumento del volumen del músculo liso de las vías respiratorias y producción excesiva de moco en las vías respiratorias45,46 a través de múltiples vías, incluidas MAPK y NF-κB46,47. En el perfil transcriptómico, al comparar las PA clave entre los grupos DEP y APM, se obtienen indicadores representativos del asma, incluidas respuestas inflamatorias, quimiotaxis, regulación positiva de la proliferación de células del músculo liso, regulación positiva del proceso biosintético del óxido nítrico, regulación positiva de la diferenciación de células endoteliales, respuesta a El interferón-γ, la diferenciación de células T involucradas en las respuestas inmunes a través de la regulación positiva de la cascada ERK1 y ERK2, la regulación positiva de la señalización de la proteína quinasa B y la regulación positiva de la cascada MAPK se identificaron solo en los grupos de APM. Estos resultados mostraron que la exposición a APM podría inducir características asmáticas en el análisis transcriptómico y en los resultados patológicos de estudios in vivo.

Finalmente, en nuestro estudio, generamos APM de aproximadamente 30 nm, que pertenece a partículas finas con un diámetro inferior a 100 nm. Incluyen una gran proporción en la atmósfera. En Tiangin, China, a principios del verano de 2018, las partículas finas constituían, en promedio, el 33 % de las PM ambientales48. La Unión Europea ha revelado que entre el 70% y el 80% de las partículas de la atmósfera tenían un diámetro pequeño, inferior a 100 nm49. Cuando las partículas pequeñas se exponían a los pulmones, se depositaban desde la faringe hasta los alvéolos, porque las vías respiratorias dependen del tamaño50. Un tamaño más pequeño induce riesgo para el sistema respiratorio, el sistema cardiovascular y todos los órganos porque pueden pasar a través de los capilares fácilmente50. En otro estudio, confirmamos estas partículas finas en los pulmones, el corazón, los riñones y el bazo debido al pequeño tamaño del APM después de la instilación de APM en los pulmones (no se muestra). Por lo tanto, nuestro APM podría ser adecuado y útil para investigar los efectos adversos de las partículas finas, incluido el inicio, el desarrollo y la exacerbación de enfermedades, incluidos los pulmones y otros órganos y mecanismos relacionados.

El estudio actual tiene algunas limitaciones. En primer lugar, es necesario analizar la composición de las MP y compararla con la composición de las MP en el aire, establecer un modelo animal que refleje varios componentes de las MP y utilizarlo para estudios toxicológicos. En segundo lugar, en este estudio, DEP y APM se trataron por vía intratraqueal. Este método es una alternativa a la inhalación y puede revelar una distribución diferente en los pulmones. Por lo tanto, se necesitan más estudios sobre la inhalación para probar la toxicidad de las PM y demostrar su mecanismo de acción en lesiones pulmonares por inhalación de PM u otros trastornos que utilizan APM.

A pesar de estas limitaciones, las observaciones actuales han revelado que el modelo animal expuesto al APM podría ayudar a estudiar los efectos adversos para la salud del PM en los pulmones al mostrar que el APM puede inducir diversas enfermedades pulmonares mediante la regulación de dosis.

Este estudio estableció un modelo animal de enfermedades pulmonares inducidas por PM utilizando APM generada en laboratorio. Nuestros resultados mostraron que tanto DEP como APM indujeron lesiones pulmonares inflamatorias. Sin embargo, la gravedad fue mayor en el grupo APM en relación con el grupo DEP. En los pulmones de ratones expuestos a DEP, sólo se observó una ligera inflamación pulmonar. Curiosamente, el APM indujo diversas enfermedades pulmonares, incluida una ligera inflamación pulmonar, inflamación granulomatosa, fibrosis pulmonar y asma, según diferentes dosis de APM en ratones. De acuerdo con estos resultados, el perfil genético transcriptómico mostró que los genes alterados por APM estaban involucrados en más PA, vías y enfermedades relacionadas con lesiones que DEP. Por lo tanto, sugerimos que un modelo animal instilado con APM tiene el potencial de estudiar el mecanismo biológico molecular de las enfermedades pulmonares inducidas por PM de acuerdo con diversos cambios de concentración, ayudando a desarrollar estrategias preventivas y terapéuticas contra las enfermedades pulmonares relacionadas con PM.

Se mantuvieron ratones macho C57BL/6 de siete semanas de edad (Orient Bio, Seongnam, Corea) que pesaban 20,31 ± 0,67 g en temperatura controlada (22 ± 3 °C) y humedad (50 ± 20%) con una luz de 12 h/12 ​​h. ciclo de oscuridad (150–300 Lux) y libre acceso a alimentos y agua del grifo. Los ratones alojados en un solo alojamiento se aclimataron durante 3 días y no mostraron signos clínicos adversos ni aumento de peso normal. Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto de Toxicología de Corea (n.° 2105-0030 y n.° 2108-0032) y se realizaron de acuerdo con las pautas de ARRIVE51.

Los ratones fueron emparejados por peso y separados aleatoriamente en siete grupos (n = 4 para el control del vehículo o n = 5 para otros grupos) utilizando el programa de software Pristima v.7.3 para estudios preclínicos (Xybion Medical Systems Corporation, Morris Plains, Nueva Jersey, EE. UU.). Los siete grupos se definieron mediante regímenes de exposición específicos de la siguiente manera: control de vehículo (VC) para agua destilada (DW) como control de DEP y APM; DEP (SRM 2975; Instituto Nacional de Estándares y Tecnología, Gaithersburg, MD, EE. UU.) para cada una de las tres dosis (1,25, 2,5 y 5 mg/kg) y APM para las tres dosis (1,25, 2,5 y 5 mg /kg). A las 24 h después de la última instilación en el vehículo, DEP o APM, se realizaron mediciones del peso de los órganos, análisis de cambios celulares y niveles de citocinas en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) y examen histológico junto con análisis transcriptómico del tejido pulmonar.

En nuestro estudio anterior, el APM a base de negro de humo se produjo a partir de grafito en diferentes rangos de temperaturas, como temperatura ambiente, 200 °C, 400 °C, 600 °C y 800 °C18. En este estudio, se generó APM a partir de grafito a 600 °C y se combinó con etileno para aumentar el nivel de HAP. Brevemente, se utilizó el generador de aerosol DNP digital 3000 (Palas GmbH, Alemania) para generar PM artificial (APM). Bajo alto voltaje, se generó una chispa entre dos electrodos de grafito a 600 °C. Después el generador se mantuvo en un alto voltaje de 2500 V y 700 Hz entre los dos electrodos de grafito suministrando gases co-mezclados con argón puro (99,999%; 7 LPM) y aire (99,999%; 10 LPM), combinado con etileno. El APM se tomó como muestra utilizando un filtro de teflón con un tamaño de poro de 2 µm y un diámetro de 47 mm (R2PJ047, PALL Corporation; EE. UU.)18,19.

Se utilizaron soluciones de sacarosa de diferentes concentraciones para la calibración del equipo (N = 5, R2 = 1,00). En el muestreo de APM se utilizaron filtros de fibra de cuarzo (filtro QMA de 25 mm, Whatman Inc., EE. UU.) sin ningún producto químico orgánico. Los componentes carbonosos en APM y DEP se analizaron utilizando un analizador de aerosoles OC-EC modelo 5 (Sunset Laboratory, Beaverton, Oregon, EE. UU.)19.

Entre los contaminantes prioritarios enumerados por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos, se seleccionaron siete HAP como objetivos en este estudio, incluidos fenantreno, antraceno, fluoranteno, pireno, benzo[a]pireno, indeno[1,2,3-c,d]. pireno y benzo[g,h,i]perileno. Los estándares de HAP utilizados para la calibración y el control de calidad se prepararon diluyendo la mezcla de HAP EPA 610 (Supelco, St. Louis, MO, EE. UU.) con metanol52.

Las partículas de HAP y n-alcanos se extrajeron mediante ultrasonicación con un disolvente de diclorometano dos veces durante 30 minutos. Los extractos se purificaron utilizando filtros de jeringa con un tamaño de poro de 0,2 μm. Las muestras de HAP en este estudio se analizaron utilizando un instrumento QP-2010 ultra GC (Shimadzu, Japón) conectado a un instrumento QP2010 ultra MS (Shimadzu, Japón) con una columna capilar DB-5MS52. La información detallada se proporciona en la Tabla 4.

DEP y APM se dispersaron en una concentración de 2 mg/ml utilizando una sonda ultrasónica (VC 505, Vibra-Cell™ Ultrasonic Liquid Processors, Sonics & Materials, Inc., EE. UU.) durante 30 min.

El tracto respiratorio es la primera vía de exposición a PM y se utilizó la administración intratraqueal para establecer un modelo animal expuesto a PM para estudios toxicológicos respiratorios. En los días 1, 5, 8, 12 y 15, a los ratones se les administró por vía intratraqueal DEP o APM (1,25, 2,5 y 5 mg/kg) dispersos en 50 µl de agua seca. Para la administración intratraqueal, los ratones se anestesiaron utilizando anestesia inhalada. Antes de la administración, se administró isoflurano en la cámara de los animales utilizando sistemas de anestesia portátiles para animales pequeños (L-PAS-02, LMSKOREA, Inc, Seongnam, Corea) equipados con un vaporizador de isoflurano. Y luego, los ratones fueron expuestos a isoflurano al 2,5% administrado en O2 (2 L/min) dentro de la cámara del animal hasta que alcanzaron un estado similar al de sueño. Los ratones que recibieron anestesia con isoflurano se sacaron de la cámara del animal, se tumbaron a bordo y la administración se realizó inmediatamente utilizando un instilador de vídeo automático. Después de la administración, los ratones se movieron, se recuperaron por completo y fueron transferidos a su jaula.

El día 16, se pesaron los pulmones, el bazo y el timo en ratones sacrificados.

A las 24 h después de la última instilación de DEP y APM, se ligó el pulmón izquierdo y se lavó lentamente el pulmón derecho tres veces utilizando el tubo traqueal con 0,7 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). El número de células totales en BALF se midió utilizando un contador NC-250 (ChemoMetec, Gydevang, Dinamarca). Para analizar células diferenciales, se realizaron frotis celulares utilizando un equipo Cytospin (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se cargaron con solución Diff-Quik (Dade Diagnostics, Aguada, Puerto, EE. UU.). Después del lavado, se montaron los portaobjetos. Se contaron un total de 200 células por portaobjetos. Además, para medir los niveles de citoquinas, se centrifugó el BALF a 2000 rpm durante 5 minutos y se recogieron los sobrenadantes.

24 h después de la última instilación de DEP y APM, los tejidos pulmonares extirpados se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% (v/v). Para la preparación de portaobjetos, los tejidos pulmonares se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 μm. Antes de la tinción, las secciones se desparafinaron con xileno. Estos se tiñeron con soluciones de hematoxilina y eosina (H&E; Sigma-Aldrich), ácido periódico de Schiff (PAS; Sigma-Aldrich) y tricrómico de Masson (MT; Sigma-Aldrich). Las secciones teñidas se analizaron bajo un microscopio óptico (Axio Imager M1; Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania). Se puntuó el grado de lesión53,54.

El ARN total se extrajo con el reactivo TRIzol (Invitrogen). La calidad y cantidad del ARN se midieron en un bioanalizador Agilent 2100 con el nanochip RNA 6000 (Agilent Technologies, Amstelveen, Países Bajos) y el espectrofotómetro ND-2000 (Thermo Inc., DE, EE. UU.), respectivamente. Para el análisis se utilizaron muestras de ARN con una relación A260/A280 > 1,8 y un valor de número de integridad de ARN (RIN) > 7.

Primero, la biblioteca se construyó utilizando el kit de preparación de biblioteca QuantSeq 3' mRNA-Seq (Lexogen, Inc., Austria) según las instrucciones del fabricante para analizar las muestras de control y de prueba. Se hibridó un cebador oligo-dT, que incluía una secuencia compatible con Illumina en su extremo 5', con los 500 ng de ARN total y se transcribió de forma inversa. Cuando se degradó la plantilla de ARN, la síntesis de la segunda cadena se inició mediante un cebador aleatorio, que incluía una secuencia conectora compatible con Illumina en su extremo 5'. Después de purificar la biblioteca bicatenaria mediante perlas magnéticas, la biblioteca se amplificó para agregar secuencias adaptadoras completas necesarias para la generación de grupos. La secuenciación de alto rendimiento se realizó como secuenciación 75 de extremo único en la plataforma NextSeq 500 (Illumina, Inc., EE. UU.), con la biblioteca final purificada por los componentes de la PCR.

En las lecturas de QuantSeq 3' mRNA-Seq alineadas por Bowtie2, los índices de Bowtie2 se generaron a partir de la secuencia de ensamblaje del genoma o de las secuencias de transcripción representativas para la alineación con el genoma y el transcriptoma. Los archivos de alineación se utilizaron para ensamblar transcripciones, estimar su abundancia y detectar los DEG. Los datos de DEG y RC (recuento de lectura) se procesaron en función de recuentos de alineaciones únicas y múltiples a través de la cobertura en Bedtools55 y en el método de normalización cuantil a través de EdgeR dentro de R usando Bioconductor56, respectivamente. Para la clasificación de genes se utilizaron la base de datos de anotación, visualización y descubrimiento integrado (DAVID; //david.abcc.ncifcrf.gov/) y las bases de datos Medline (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Para clasificar y comparar los genes alterados por DEP y APM en grupos de animales con patrones de toxicidad pulmonar similares, cada gen fue asignado a las categorías adecuadas según su función celular principal. Para realizar el análisis transcriptómico, los DEG se definieron bajo una combinación de cambio de veces ≥ 1,5 y valor de p <0,05. DAVID y el análisis de rutas se utilizaron para determinar términos GO significativamente sobrerrepresentados y para determinar las rutas significativas para DEG de la base de datos KEGG (//www.genome.jp/kegg/), respectivamente. La identificación del enriquecimiento sustancial de la vía y los valores de p se ajustaron utilizando la prueba exacta de Fisher y el algoritmo de tasa de descubrimiento falso (FDR) de BH, respectivamente. Las categorías de vías se informaron con FDR <0,05. Además, se utilizó el CTD (http://ctdbase.org) para analizar las interacciones entre genes y enfermedades mediante la exposición a DEP y APM en ratones. En este estudio, se identificaron y analizaron genes que se alteraron tras la exposición a DEP o APM de manera dependiente de la dosis.

Los datos se expresaron como la media ± (DE). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Los datos se examinaron para determinar la varianza en la homogeneidad mediante la prueba de Brown-Fosythe o la prueba de Bartlett. Los datos homogéneos se analizaron mediante análisis de varianza y las comparaciones estadísticas se realizaron mediante el análisis de varianza unidireccional, seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Un valor de p <0,05 indicó significación estadística.

Los experimentos con animales se llevaron a cabo siguiendo los protocolos aprobados por el IACUC del Instituto de Toxicología de Corea (no. 2105-0030 y no. 2108-0032) y se llevaron a cabo de acuerdo con todas las pautas y regulaciones.

Los datos utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio están disponibles a pedido del autor correspondiente.

Procesos biológicos

Base de datos comparativa de toxicogenómica.

Expresión diferencial de genes.

Partículas de escape diésel

Agua destilada

Carbono elemental

Quinasa regulada por señales extracelulares

Tasa de falso descubrimiento

Ontología de genes

Hematoxilina y eosina

Comité institucional de cuidado y uso de animales.

Enciclopedia de Kioto para genes y genomas.

Proteína quinasa activada por mitógenos

Tricromo de Masson

NF-kappaB

Carbón orgánico

hidrocarburo aromático policíclico

Solución salina tamponada con fosfato

Materia particular

Leer recuento

número de integridad del ARN

Desviación Estándar

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Toxicología de Corea (Subvención No. KK-2203), el Programa Institucional KIST (Programa de Investigación del Medio Ambiente Atmosférico, Subvenciones Nos. SK-2204; 2E31700-22-P008) y el Desarrollo de Tecnología Bio y Médica. Programa de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) financiado por el gobierno coreano (MSIT) (No. 2022M3A9E4082651).

Departamento de Investigación sobre Inhalación de Jeonbuk, Centro de Toxicología por Inhalación para Factores de Riesgo Transmitidos por el Aire, Instituto de Toxicología de Corea, 30 Baekhak1-Gil, Jeongeup, Jeollabuk-Do, 56212, República de Corea

Dong Im Kim, Mi-Kyung Song, Ji Eun Yuk, Hyeon Jin Seo y Kyuhong Lee

Departamento de Toxicología Humana y Ambiental, Universidad de Ciencia y Tecnología, Daejeon, 34113, República de Corea

Mi Kyung Song y Kyuhong Lee

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DIK diseñó el estudio, realizó experimentos con modelos de ratones, trabajos moleculares que incluyen recuentos de células y niveles de proteínas e IgE, interpretó datos y escribió el manuscrito. M.-KS analizó el perfil transcriptómico y editó el manuscrito. JEY realizó los experimentos con modelos de ratones. HJS analizó la relación OC/EC y el nivel de HAP. KL interpretó los datos, editó el manuscrito y supervisó este estudio. Todos los autores contribuyeron a la edición del manuscrito. Todos los autores leyeron y revisaron el manuscrito final.

Correspondencia a Kyuhong Lee.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Kim, DI, Song, MK., Yuk, JE et al. Establecimiento de un modelo de enfermedad pulmonar inducida por partículas artificiales mediante el análisis de cambios patológicos y perfiles transcriptómicos en ratones. Informe científico 13, 5955 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29919-9

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Recibido: 03 de noviembre de 2022

Aceptado: 13 de febrero de 2023

Publicado: 12 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29919-9

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